列奥纳多继承了卡氏对宗教题材的情节化的处理方式——在画中讲一个生动、真实的故事。这种宗教题材的世俗化倾向在15世纪有了更进一步的发展。当时，许多画家喜欢把圣经故事展现于此时此地的现实环境中，并常常在其中画上自己和朋友的形象，以此为荣。
列奥纳多采用了平行透视法，运用了最为传统的一字形排开的构图惯例，让中心焦点集中于耶稣的明亮的额头。耶稣伸开双手，低垂双眼。他已经把话说完，沉默着。但是，他的手势却有着不可抗拒的精神的号召力，召示和启迪人们去内省，去沉思。
作品运用了高超的明暗技法，“达·芬奇被认为是明暗对比法之父，尤其是他的《最后的晚餐》，在较后的艺术中第一次大规模地把明暗用作构图因素。”所有人物都被统摄于神秘而宁静的光影之中。不同于卡斯塔尼奥等三位画家，列奥纳多用阴影消除了背景中应该会有的所有的细节。
沃尔夫林说，为了精神统一的需要，在列奥纳多的作品中，“仅仅能够给观者快感或分散注意力的因素都从场景中取消了。只有能够满足这个主题迫切需要的东西，才被提供给想象力。没有一样东西是为了它自己而存在的：画里的一切都是为了整体。”推荐：独领风骚的艺术巨匠，蒋兆和的绘画艺术
十二门徒的情感充溢，动作强烈，展现出了列奥纳多观察和塑造各类人物的才能。同时，以基督为中心，他们被相当有序地组合成左右平衡的四组。巧妙的组合使他们获得了秩序的宁静。犹大本人的“隐退”，使得由他而起的众门徒的激情转化成了“无声的喧哗”，成了耶稣这一“最强音”的“和声”。正是由于这一对比，耶稣的沉默显示出了巨大的力量。贡布里希曾用“哑剧”一词来描述这一作品的场景气氛，可谓意味深长。
沃尔夫林认为列奥纳多在《最后的晚餐》这一作品中体现出来的种种“同一性”，预示了巴洛克风格的到来。他把圣经文本中存在的“圣餐设立”和“宣告背叛”这两部分相矛盾的内容和谐地统一在了一起，这种创造能力同样是史无前例的。
也许，正是因为列奥纳多在15年前尝试这种独创性的“哑剧”手法不甚成功，致使他的《三贤士来朝》永远停留在了草图阶段。而《最后的晚餐》这一杰作终于成功地使艺术新成就与历代优秀的艺术传统以及题材固有的文化内含如此完美和谐地统一在了一起。
当然，列奥纳多的创作不可能再回到普里西拉墓室的“分面包”的多义性之中去，他也不可能采用中世纪时期冷冰冰的图案符号式的人物造型和手法。经过几代人文主义者和艺术大师们的努力，悠久而丰富的古代文化，与现实生活的人性与情感在艺术的创作中是不应该再被分离的了。列奥纳多的《最后的晚餐》在文化传统的继承和创新发展的结合上是做得最好的典范之一。
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